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[ct重组技术名词解释]重组dna技术的名词解释|操作步骤|产业现状

理论文章 |

时间:

2020-01-11

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  重组dna技术的名词解释

  基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因按预先设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

  重组dna技术的操作步骤

  工具

  (1)酶:限制性核酸内切酶、DNA连接酶、

  (2)载体:质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体

  1.提取目的基因

  获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病(抗病毒 抗细菌)基因,种子的贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因干扰素基因等,都是目的基因。

  要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因,是十分不易的。科学家们经过不懈地探索,想出了许多办法,其中主要有两条途径:一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。

  直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是:用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增,如使用PCR技术),从中找出含有目的基因的细胞,再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

  用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段,一般使用人工合成的方法。

  人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

  2.目的基因与运载体结合

  基因表达载体的构建(即目的基因与运载体结合)是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。

  将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体,首先要用一定的限制酶切割质粒,使质粒出现一个缺口,露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端(部分限制性内切酶可切割出平末端,拥有相同效果)。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处,首先碱基互补配对结合,两个黏性末端吻合在一起,碱基之间形成氢键,再加入适量DNA连接酶,催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来,形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合,形成重组DNA分子(也叫重组质粒)的。

  3.将目的基因导入受体细胞

  将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后,下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。

  基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌,枯草杆菌,土壤农杆菌,酵母菌和动植物细胞等。

  用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞,主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如,如果运载体是质粒,受体细胞是细菌,一般是将细菌用氯化钙处理,以增大细菌细胞壁的通透性,使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后,就可以随着受体细胞的繁殖而复制,由于细菌的繁殖速度非常快,在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。

  4.目的基因的检测和表达

  目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。

  以上步骤完成后,在全部的受体细胞中,真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此,必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达过程。

  重组dna技术的产业现状

  1989年,中国批准了第一个在中国生产的基因工程药物——重组人干扰素αlb,标志着中国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素αlb是世界上第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物,也是到目前为止唯一的一个中国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。从此以后,中国基因工程制药产业从无到有,不断发展壮大。1998年,中国基因工程制药产业销售额已达到了7.2亿元人民币。截止1998年底,中国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计15种。国内已有30余家生物制药企业取得了基因工程药物或疫苗试生产或正式生产批准文号。

  根据1997年对全国452从个事生物技术研究、开发和生产的单位进行的通讯调查结果,截止1996年底,中国已有8种基因工程药物和疫苗商品化(包括试生产),1996年基因工程药物和疫苗销售额约为2.2亿元人民币,仅占同期全国医药生物技术产品年销售额21.16亿元人民的10.4%。然而可喜的是,中国基因工程制药产业发展迅猛,年销售额已从1996年的2.2亿元人民币增长到1998年的7.2亿元人民币,年均增长率高达80%。预计2000年中国基因工程药物销售额将达到22.8亿元人民币。

  基因工程在制药业中具有广阔的发展前景,中国的基因制药行业已经初具规模,但与世界发达国家存在差距,主要表现在具有自主知识产权的产品较少,产业规模小、经济效益低。基因制药产业面临着历史性的机遇,主要表现在政府支持、资源丰富、基因信息公开、国际交流增加等方面。提高自主开发能力、保护基因资源是当前亟待解决的问题,同时,应加强对基因制药领域技术壁垒的研究与准备。

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